żeromskiego 87 radom

Gdy uszkodzenie zostało naprawione w BAC, pojawiły się alternatywne defekty w locus UL128 przez p3 (p4. W innych badaniach monitorujących tropizm komórek śródbłonka w izolatach klinicznych odnotowano utratę fenotypu w fibroblastach po p20 (44), p22 (45) lub p15 p20 (28). Takie badania określiły przejście wirusa. jako odpowiadającej każdej seryjnej subkulturze (zwykle raz w tygodniu) monowarstwy zainfekowanej komórki. Jednakże, w niniejszym badaniu, pasaż wirusa obejmował zniszczenie całej monowarstwy komórek po zakażeniu wirusem wolnym od komórek, proces, który zwykle obejmuje wiele więcej cykli replikacji wirusa. Ponadto, biorąc pod uwagę, że wirusy zmutowane w locus UL128 uwalniały większe ilości wirusa do pożywki, nasze użycie wirusa wolnego od komórek mogło dodatkowo zachęcać do selekcji mutantów. Identyfikacja mutacji RL13 w pAL1053 była nieoczekiwana, ponieważ sekwencja genomu Merlin (p3) wskazała, że ten region kodujący był nienaruszony (27). Doprowadziło to do odkrycia, że zasoby Merlina o niskim przepływie składały się w rzeczywistości z mieszanin różnych różnych mutantów RL13. To odkrycie przynosi rozwiązanie z obserwacjami, że prawie wszystkie szczepy HCMV i BAC są jawnie zmutowane w RL13 (27). Istnieją równoległe między RL13 a locus UL128 w tym, że mutacje pojawiają się w obu genach podczas adaptacji do hodowli w fibroblastach. Jest jednak jasne, że RL13 i locus UL128 mogą funkcjonować niezależnie, ponieważ każdy gen w nienaruszonej formie był zdolny do tłumienia replikacji wirusa, a naprawa obydwu miała efekt addytywny. Pokazano także, że fenotyp RL13 różni się od fenotypu locus UL128, ponieważ RL13 hamował replikację HCMV zarówno w fibroblastach, jak i komórkach nabłonkowych, podczas gdy locus UL128 był nie tylko stabilny, ale także sprzyjał infekcji, w komórkach nabłonkowych. Niemniej jednak odkrycie, że gpRL13 jest obecny w wirionie wskazuje, że może on odgrywać rolę w modyfikowaniu tropizmu (podobnego do locus UL128) lub w modulowaniu sygnalizacji komórkowej podczas wprowadzania wirusa (jak zaproponowano dla gB). Widoczna łatwość, z jaką mutanty RL13 zostały wybrane w hodowli komórkowej, zwiększyła możliwość, że przeszły one wcześniej w próbce klinicznej, prawdopodobnie odzwierciedlając potencjał dla rozszerzonego tropizmu komórkowego in vivo. Ta możliwość jest technicznie trudna do obalenia, ponieważ takie mutanty mogą występować w bardzo małych proporcjach. Jednakże nie byliśmy w stanie wykryć obecności mutantów RL13 w pierwotnej próbce klinicznej, z której wyprowadzono Merlina. Oszacowano, że około około 106 cząsteczek zostało użytych w początkowej infekcji kolby o pojemności 25 cm2 w celu izolacji Merlin, a to spowodowałoby, że większość komórek otrzymywała cząstkę. Niemniej jednak, przejście Merlina trwało 4 tygodnie. Wskaźnik mutacji wirusów DNA jest stosunkowo niski i został obliczony na 0,003 na replikację genomu dla HSV-1 (65). Jeśli ta wartość jest zachowana dla HCMV, oczekuje się, że mutanty w locus UL128 i / lub RL13 pojawią się podczas p1. Ten wskaźnik mutacji działający na 106 wirusach dałby w sumie 3000 mutacji na replikację genomu. Ponieważ RL13 odpowiada za 879/235 646 pz w genomie Merlin, około 11 mutacji będzie w RL13. Nabycie mutacji zarówno w RL13 jak i UL128 mogło wynikać z sekwencyjnych mutacji w tej samej matrycy lub w wyniku rekombinacji pomiędzy niezależnymi mutantami. Pomimo nieintuicyjnego charakteru tak szybkiej selekcji w herpeswirusie, mutacje w RL13 i locus UL128 zidentyfikowano również w p3 po transfekcji naprawionych BAC do HFFF i były one wyraźnie generowane de novo. Co ciekawe, mutanty pojawiły się w RL13 szybciej niż w locus UL128. Niektóre dane wskazują również, że RL13 może mutować szybciej w kontekście zmutowanych wirusów UL128; może to jednak po prostu odzwierciedlać wolniejszy rozwój wirusa WT. Na poparcie naszych wniosków dotyczących niestabilności RL13 w hodowli komórkowej, wspólne badania wykazały, że mutanty RL13 były niezmiennie wybierane w fibroblastach, komórkach nabłonkowych i śródbłonkowych podczas sekwencyjnego przejścia szczepów HCMV z próbek klinicznych (28)
[więcej w: zespół lyncha, zespół mielodysplastyczny, zapalenie nerwu twarzowego ]