woreczek żółciowy kamica

Dziewięć klonów było sekwencją WT w sekwencji, a jeden klon zawierał jedno synonimiczne podstawienie (A (G w nt 11959). Ta substytucja nie została wykryta w żadnej wersji Merlin z pasażowania w hodowli komórkowej, a zatem najprawdopodobniej wynikała z błędu PCR. Dane te wskazują, że RL13 był głównie WT w próbce klinicznej i są zgodne z mutantami RL13, które powstały i zostały wybrane podczas hodowli komórkowej. Właściwości wzrostu wirusa generowanego z BAC Merlin. Wirus (RCMV1111) był łatwo odzyskiwany z HFFF transfekowanych pAL1111 (Figura 1) i wykazywał profil endonukleazy restrykcyjnej identyczny z profilem Merlin (p5) (Figura 3A). Diagnozę wzorcową obecności wszystkich 4 izoform genomu można było odróżnić w liniowym genomie RCMV1111. Infekcje HFFF przy niskim MOI (0,01 PFU / komórkę) wykazały, że RCMV1111 wzrastał z kinetyką porównywalną do kinetyki Merlin (p5) (Figura 3B). Figura 3 Właściwości wirusa pochodzącego od BAC Merlin RCMV1111. (A) Profile endonukleazy restrykcyjnej DNA wyekstrahowanego z Merlin (p5), RCMV1111 (wirus pochodzący z pAL1111) i pAL1111. Pokazane są znaczniki (kb). (B) Miana wirusa uwalniane do po zakażeniu HFFF z MOI wynoszącym 0,01 PFU / komórkę. Paski błędów pokazują się. SD; wyniki są reprezentatywne dla 2 eksperymentów. (C) Wewnątrzkomórkowe barwienie FACS dla białka US28 w komórkach w różnych czasach PI z Merlinem (p5) lub RCMV1111. Pokazano kontrole w postaci próbek zabarwionych IgG. (D) Skopiuj numery transkryptów US29 w stosunku do transkryptów UL123 (IE1) w różnych czasach PI z Merlinem (p5) lub RCMV1111. Liczby uśredniono z 3 eksperymentów; paski błędów pokazują. SD. (E) Miana wirusa uwalniane do pożywki po infekcji HFFF przy MOI 0,01 PFU / ml z RCMV1158 lub RCMV1111. Paski błędów pokazują się. SD; wyniki są reprezentatywne dla 2 eksperymentów. Podczas generowania RCMV1111 wektor BAC został wycięty z genomu, pozostawiając jedynie resztkową sekwencję 40 pz pomiędzy US28 i US29. Wewnątrzkomórkowe FACS wskazało, że RCMV1111 eksprymował białko US28 podczas przebiegu infekcji produkcyjnej w obfitości porównywalnej z Merlinem (p5) (Figura 3C). Ponieważ przeciwciało nie było dostępne dla białka US29, poziomy transkryptu US29 wyrażane przez RCMV1111 i Merlin (p5) były mierzone za pomocą ilościowego RT-PCR (QRT-PCR) (Figura 3D), z zastosowaniem UL123 (IE1) jako standard, i były porównywalny. Tak więc, pozostałe 40 pz w RCMV1111 nie miało dostrzegalnego wpływu na ekspresję sąsiadujących genów US28 i US29. Ekspresja eGFP przez wirus generowany z BAC Merlin. Aby ułatwić scharakteryzowanie wirusów wytwarzanych z BAC Merlin, kasetę ekspresyjną IRES-eGFP wstawiono do pAL1111 bezpośrednio poniżej UL122 (IE2), tak że ekspresja znajdowała się pod kontrolą głównego promotora IE (60), generując pAL1158. W powstałym wirusie (RCMV1158), eGFP ulegał ekspresji z kinetyką IE (dane nie pokazane). W badaniach wzrostu przeprowadzonych przy niskim MOI (0,01 PFU / komórkę) w HFFF, RCMV1158 wykazywał małe, lecz konsekwentne obniżenie poziomów wytwarzania wirusa (2-krotnie) w 12 dniu po zakażeniu (PI) (Figura 3E). Naprawa RL13 lub UL128 powoduje defekty wzrostu w fibroblastach. W celu odtworzenia kompletnego dopełniacza genu HCMV, zmiany w UL128 i RL13 w pAL1111 zostały naprawione bezproblemowo przez rekombinację, zarówno pojedynczo, jak i w połączeniu, zakończone zestawem 4 BAC (pAL1111, pAL1119, pAL1120 i pAL1128; . Kompletna sekwencja w pełni naprawionego BAC (pAL1128) została zweryfikowana przez sekwencjonowanie Solexa. Odpowiedni zestaw BAC znakowanych eGFP został również skonstruowany (pAL1158, pAL1159, pAL1160 i pAL1161, tabela 3). Tabela 3 WT (+), zmutowany (a) status RL13 i UL128 w Merck BACs Aby ocenić skuteczność rozprzestrzeniania się wirusa z komórki do komórki, 4 BGs znakowane eGFP były transfekowane pojedynczo do HFFF, komórki zostały nałożone, a następnie obszary łysinek zmierzono w 3 tygodnie po transfekcji (PT) (Figura 4 i Figura 5A)
[podobne: zespół mielodysplastyczny, ziarnica zlosliwa, zielony jęczmień zastosowanie ]