tomografia komputerowa szczecin ul arkońska

Naszym celem było sklonowanie kompletnego genomu szczepu Merlin HCMV przez wstawienie wektora BAC do niekodującego regionu między genami wirusa US28 i US29. Wstępne badania (dane niepokazane) wskazały, że bezpośrednia insercja wektora kierującego BAC do genomu HCMV przez rekombinację homologiczną podczas wzrostu wirusa w pierwotnych ludzkich płodowych fibroblastach napletka (HFFF) była związana z kompensowaniem delecji w sekwencjach wirusa, prawdopodobnie z powodu rozmiaru genomu ograniczenia działające podczas pakowania DNA wirusa. Wektor docelowy BAC został więc przeprojektowany w celu zastąpienia regionu genomu HCMV zawierającego US29SUS34 (Figura 1). DNA wektora BAC transfekowano do HFFF, które były nadinfekowane szczepem Merlin (p5) HCMV, i do selekcji rekombinantów zastosowano selekcję puromycyny. Okrągłe DNA ekstrahowano i elektroporowano do E. coli. Ogółem 22 klony analizowano przez trawienie endonukleazą restrykcyjną (dane nie przedstawione), a wszystkie zawierały genom HCMV minus US29. US34. Ponieważ zarówno UL jak i US mogą być obecne w obu orientacjach w genomie HCMV, liniowa cząsteczka będzie jedną z 4 izomerów, a kołowa cząsteczka jedną z 2. Profile endonukleazy restrykcyjnej odpowiadające obu kolistym konformacjom zostały wykryte wśród klonów BAC (dane nie pokazane). Pojedynczy klon (pAL1031, Figura 1) z 12 klonów z UL i US obecnych w standardowym układzie został wybrany do dalszej analizy. Rysunek Kroki w konstrukcji pAL1111. Przybliżona lokalizacja miejsca wstawienia wektora BAC między US28 i US29 w regionie USA genomu HCMV jest pokazana na górze. Nazwy BAC (seria PAL) i wirusy (seria RCMV) są pokazane po prawej stronie. Pola wskazują regiony kodujące białko (oznaczone), a kręgi oznaczają miejsca loxP (L). Pudełko BAC reprezentuje pBeloBAC11, pudełko eGFP / Puro reprezentuje kasetę eksprymującą eGFP i białko oporne na puromycynę, a pole Cre reprezentuje gen rekombinazy Cre zawierający syntetyczny intron. Rekombinacja (55, 56) została użyta do wstawienia regionu US293 US34 do pAL1031, generując w ten sposób pAL1040, który zawiera cały genom Merlin (Figura 1). Technologia Cre / lox została wcześniej zastosowana w celu ułatwienia wycinania sekwencji wektora prokariotycznego (również zlokalizowanego między US28 i US29) z BAC AD169 po transfekcji do HFFF (53). Przyjęliśmy tę strategię, aby wyprodukować samorozcinający BAC Merlin przez 2 rundy rekombinacji, w której wzmocniona kaseta GFP (eGFP) / Puro w pAL1040 została zastąpiona przez gen kodujący rekombinazę Cre, generując w ten sposób pAL1053 (Figura 1). Wersja użytego Cre zawierała syntetyczny intron, aby zapobiec jego ekspresji w E. coli (57, 58). Po transfekcji do HFFF jednak rekombinaza Cre ulegała ekspresji i pośredniczyła w usuwaniu wektora BAC przez rekombinację między miejscami loxP zaprojektowanymi na skrzyżowaniach z genomem wirusa. Tak więc, jedynymi egzogennymi sekwencjami pozostałymi w wirusie wytworzonym z pAL1053 i następujących po nim BAC były te z pojedynczych miejsc loxP i NheI (łącznie 40 pz) zlokalizowanych między US28 i US29 (Figura 1). Sekwencja BAC pAL1053. Sekwencjonowanie całego komponentu HCMV w pAL1053 potwierdziło, że cały genotyp Merlin został schwytany i że pojedynczy a / a. sekwencja była obecna między b i c, i b. i c ., sekwencje. Podobnie jak w Merlin (p3), pAL1053 zawierał podstawienie G do A (G. A) w nt 176311, które wprowadza kodon stop w ramce i prowadzi do przedwczesnego zakończenia białka UL128. pAL1053 różniło się od Merlina (p3) w sumie w 12 lokalizacjach (Tabela 1). Obejmowały one 5 podstawień zgrupowanych w UL36. Sekwencje produktów PCR amplifikowanych z oryginalnego materiału klinicznego, Merlin (p3), najwcześniejszy prekursor BAC z pAL1053 (pAL1031) i 10 dodatkowych BAC Merlin z tego samego stadium co pAL1031 pokazały, że mutacje te występowały tylko w pAL1031, podczas gdy sekwencje ze wszystkich innych źródeł były identyczne jak sekwencja Merlin (p3)
[podobne: zapalenie ucha u dziecka objawy, zatorowość płucna objawy, zielony jęczmień gdzie kupić ]