szpital parkitka częstochowa tomografia

Ponieważ RL13 nie było wcześniej scharakteryzowane, ważne było ustalenie i zbadanie jego ekspresji. RL13 oznaczono zatem sekwencją kodującą C-końcowy epitop V5 i wstawiono do wektora rekombinowanego adenowirusa (RAd). Epitop V5 był także połączony z RL13 w obrębie szczepu BAC Merlin, zarówno w UL128. (RCMV1279) i tło UL128 + (RCMV1280) (Tabela 3). Przewiduje się, że pierwotny produkt translacji RL13 będzie białkiem 35 kDa zawierającym sekwencję sygnałową, domenę przezbłonową, 7 potencjalnych miejsc glikozylacji z wiązaniem N i 26 potencjalnych miejsc glikozylacji O-połączonych. Gdy RL13V5 eksprymowano w izolacji przy użyciu wektora RAd, wykryto białka 80 kDa i 55 kDa (Figura 7A), podczas gdy gatunki 100 kDa i 55 kDa wykryto w komórkach zakażonych RCMV1279 (RL13V5 + UL128 .; Figura 7B). ). Białka o masie 55 kDa były wrażliwe na trawienie EndoH, co wskazuje na to, że są one niedojrzałymi postaciami zatrzymanymi w ER, podczas gdy białka 80- i 100-kDa były oporne na trawienie EndoH i dlatego są prawdopodobnie w pełni dojrzałe. Trawienie PNGazą F zredukowało białka o masie 55 kDa do 35 kDa, a ponadto zredukowało białka o 80 i 100 kDa odpowiednio do 57 i 65 kDa. Ponieważ żaden z enzymów nie był w stanie zredukować białek o 80- i 100-kDa do 35 kDa, jest prawdopodobne, że dojrzały gpRL13 zawiera O-połączone, jak również N-połączone cukry. Identyczne wyniki uzyskano dla komórek zakażonych RCMV1280 (RL13V5 + UL128 +) i nie zaobserwowano żadnych pasm przy użyciu lizatów z RL13. wirus (dane nie pokazane). Obserwacja, że gpRL13 wydaje się być w większym stopniu glikozylowana w kontekście zakażenia HCMV niż gdy jest wyrażana w izolacji, jest zgodna z poprzednimi obserwacjami dotyczącymi CD155 i gpUL18, z tym, że infekcja HCMV zmienia normalne procesy glikozylacji komórkowej (22, 61). Figura 7 Charakterystyka gpRL13. (A i B) Western blot przeprowadzono na RL13V5, pokazując rozmiary białek w natywnej postaci lub po trawieniu za pomocą EndoH lub PNGaseF. RL13V5 był albo eksprymowany w izolacji z RAd (A) albo z jego natywnej pozycji w RCMV1279 (B). (C) Immunofluorescencja przeprowadzona dla wskazanych antygenów na HFFFs zakażonych RL13V5 wyrażającym RAd (powiększenie × 640). (D i E) Immunofluorescencja przeprowadzona dla wskazanych antygenów na HFFF zakażonych RCMV1279 lub na ARPE-19 zakażonych RCMV1280. Oryginalne powiększenie, × 640. Epitop V5 był również stosowany do śledzenia ekspresji gpRL13 przez immunofluorescencję. Gdy RL13V5 ulegał ekspresji przy użyciu wektora RAd, gpRL13 przemycano do oddzielnych pęcherzyków cytoplazmatycznych, których część mogła być wybarwiona wczesnym markerem endosomalnym Rab5A (Figura 7C). Ta obserwacja jest zgodna z dużą ilością białka przechodzącego przez aparat Golgiego. W kontekście produktywnego zakażenia HCMV dystrybucja wewnątrzkomórkowa gpRL13 była różna. Białko zlokalizowane w miejscu cytoplazmatycznym składania wirionów i kolokalizowane zarówno w HFFF, jak i ARPE-19 z markerem dla sieci trans-Golgi (TGN46) i pp28 (zewnętrzne białko nakłujące kodowane przez gen UL99, który wchodzi w interakcje z otoczką i jest nabywane przez wirion w cytoplazmie, Figura 7D) i gH (glikoproteina otoczki wirionu kodowana przez gen UL75, Figura 7E). Stwierdzenie, że gpRL13 jest glikoproteiną, która śledzi miejsce zgromadzenia wirionów, stwarza możliwość, że może być wirionem powierzchniowym białka wirionowego. Wzrost RL13 + HCMV in vitro jest nieefektywny i powstają spontaniczne mutanty, które zostaną szybko wybrane (patrz powyżej). Niemniej jednak odkryliśmy, że ograniczony, krótkotrwały wzrost wirusa RL13 + może być wspierany przez kolejne ponowne wysiewanie hodowli (Figura 5), a przeciwciało do znacznika C-końcowego będzie preferencyjnie rozpoznawać pełnej długości, niezmutowane gpRL13, nawet jeśli proporcja mutanty powstały podczas przejścia
[hasła pokrewne: zapalenie przyzębia, wash master, zespół lyncha ]