olkusz apteka dyżur

Użyliśmy metody współczynnika prędkości do określenia stałej hamowania Ki dla każdego związku, jak już wcześniej informowaliśmy (9, 52) (patrz poniżej, Równanie 1). Ponieważ naszym celem było wybranie blokerów o najwyższym powinowactwie, zastosowaliśmy surowe kryterium, że Ki nie powinna być większa niż 3 x Kd dla wiązania A (3 / RAGE w komórkach RAGE-CHO. Korzystając z tego kryterium, zidentyfikowaliśmy 3 wiodące blokery o wysokim powinowactwie z 7, o nazwach FPS1, FPS2 i FPS3. Jeden z tych związków (tj. FPS2) był lepszym blokerem wiązania 125I-A350 z RAGE niż nieznakowany A. sam, gdy był badany przy porównywalnych stężeniach równomolarnych, tj. stosunek Ki / Kd wynosił 0,66 (tabela 1). Pozostałe 4 związki nie zostały uwzględnione w dalszych badaniach z powodu ich względnie niskiego powinowactwa jako inhibitorów A (3 / RAGE. Zastosowaliśmy test wiązania 125I-Ay40A w komórkach RAGE-CHO dla ekranu biblioteki wtórnej. Bibliotekę drugiej generacji złożoną ze 100 związków zsyntetyzowano tak, jak wyjaśniono w Results, w celu uzyskania związku o zwiększonej przepuszczalności BBB, ale nadal o wysokim powinowactwie, w celu zahamowania wiązania Ap / RAGE. Używając rygorystycznego kryterium, że Ki inhibitora wiodącego powinno być porównywalne z FPS2, badanie wtórne wykazało związek ze 100 (tj. FPS-ZM1), który spełniał oba kryteria, tj. Zwiększoną przepuszczalność BBB i blokadę o wysokim powinowactwie. Powiązanie A / RAGE (Tabela 1). Związki wiodące z pierwotnego (tj. FPS2) i drugorzędowego (tj. FPS-ZM1) badano następnie w różnych stężeniach (tj. Od 10 do 1000 nM) pod kątem ich skuteczności w hamowaniu wiązania Ap / RAGE w wielu komórkach. testy wolne i oparte na komórkach, jak opisano poniżej (patrz testy bez komórek i testy oparte na komórkach). Stała hamowania, Ki. Stałą hamującą (Ki) określono przy użyciu równania 1, jak podano (9, 52). Ki (nM) = (Bi x Kd x Ci) / (Boj Bi) (Kd + CAa) (równanie 1) gdzie Bo i Bi to 125I-A. wiązanie pod nieobecność i obecność inhibitora, a Ci i CA. oznaczają stężenia odpowiednio w pożywce inhibitora (50 nM) i 125I-A r40 (5 nM). Kd jest stałą wiązania A. określone w oddzielnym zestawie badań (patrz poniżej, wiązanie A (3 z komórkami RAGE-CHO) i opisane wcześniej (32). Testy bez komórek Wiązanie A. i inne ligandy do SRAGE. Ludzki sRAGE uzyskany z BioVendor został unieruchomiony (10 .g / ml) przez noc w temperaturze 4 ° C na 96-studzienkowych płytkach do mikromiareczkowania i zablokowany 3% albuminą surowicy bydlęcej. Znakowane 125I Ap40, HMGB1 lub S100B w stężeniu 5 nM w nieobecności i obecności różnych stężeń FPS2 lub FPS-ZM1 (10 do 1000 nM) dodano do studzienek (w trzech powtórzeniach) zawierających unieruchomiony test SRAGE i inkubowano przez godzinę. godzinę w temperaturze pokojowej w PBS. Studzienki przemyto zimnym PBS w celu usunięcia niezwiązanych znakowanych radioaktywnie ligandów, a radioaktywność analizowano przy użyciu licznika Gamma Gamma Wallac Wizard. Efekty specyficznej dla RAGE domeny V, domeny C1 i przeciwciał domeny C2 (20 .g / ml) (dostarczonych przez Gunter Fritz) na wiązanie 125I-A 40 (5 nM) do unieruchomionego sRAGE określono w obecności i nieobecności. 100 nM FPS-ZM1. Wiązanie 125I-ligandów z unieruchomionym sRAGE lub jego rekombinowanymi domenami w obecności różnych potencjalnych inhibitorów (np. FPS2, FPS-ZM1, przeciwciała RAGE) wyrażono jako procent kontrolnego wiązania ligandów znakowanych 125I pod nieobecność inhibitorów, które został arbitralnie przyjęty jako 100%. Wiązanie A. do domen RAGE. Rekombinowaną ludzką domenę V RAGE i domeny C1. C2 (dostarczone przez Gunter Fritz) unieruchomiono (10. G / ml) przez noc w 4 ° C na 96-studzienkowych płytkach do mikromiareczkowania i zablokowano 3% albuminą surowicy bydlęcej. Wiązanie 125I-Ay40 (5 nM) z unieruchomioną domeną V i domenami C1. C2 określono w obecności i przy braku 100 nM FPS-ZM1.
[więcej w: zakrzepica żył objawy, zespół fallota, zespół tietza ]