Użyliśmy metody współczynnika prędkości do określenia stałej hamowania Ki dla każdego związku, jak już wcześniej informowaliśmy (9, 52) (patrz poniżej, Równanie 1). Ponieważ naszym celem było wybranie blokerów o najwyższym powinowactwie, zastosowaliśmy surowe kryterium, że Ki nie powinna być większa niż 3 x Kd dla wiązania A (3 / RAGE w komórkach RAGE-CHO. Korzystając z tego kryterium, zidentyfikowaliśmy 3 wiodące blokery o wysokim powinowactwie z 7, o nazwach FPS1, FPS2 i FPS3. Jeden z tych związków (tj. FPS2) był lepszym blokerem wiązania 125I-A350 z RAGE niż nieznakowany A. sam, gdy był badany przy porównywalnych stężeniach równomolarnych, tj. stosunek Ki / Kd wynosił 0,66 (tabela 1). Pozostałe 4 związki nie zostały uwzględnione w dalszych badaniach z powodu ich względnie niskiego powinowactwa jako inhibitorów A (3 / RAGE. Zastosowaliśmy test wiązania 125I-Ay40A w komórkach RAGE-CHO dla ekranu biblioteki wtórnej. Bibliotekę drugiej generacji złożoną ze 100 związków zsyntetyzowano tak, jak wyjaśniono w Results, w celu uzyskania związku o zwiększonej przepuszczalności BBB, ale nadal o wysokim powinowactwie, w celu zahamowania wiązania Ap / RAGE. Używając rygorystycznego kryterium, że Ki inhibitora wiodącego powinno być porównywalne z FPS2, badanie wtórne wykazało związek ze 100 (tj. FPS-ZM1), który spełniał oba kryteria, tj. Zwiększoną przepuszczalność BBB i blokadę o wysokim powinowactwie. Powiązanie A / RAGE (Tabela 1). Związki wiodące z pierwotnego (tj. FPS2) i drugorzędowego (tj. FPS-ZM1) badano następnie w różnych stężeniach (tj. Od 10 do 1000 nM) pod kątem ich skuteczności w hamowaniu wiązania Ap / RAGE w wielu komórkach. testy wolne i oparte na komórkach, jak opisano poniżej (patrz testy bez komórek i testy oparte na komórkach). Stała hamowania, Ki. Stałą hamującą (Ki) określono przy użyciu równania 1, jak podano (9, 52). Ki (nM) = (Bi x Kd x Ci) / (Boj Bi) (Kd + CAa) (równanie 1) gdzie Bo i Bi to 125I-A. wiązanie pod nieobecność i obecność inhibitora, a Ci i CA. oznaczają stężenia odpowiednio w pożywce inhibitora (50 nM) i 125I-A r40 (5 nM). Kd jest stałą wiązania A. określone w oddzielnym zestawie badań (patrz poniżej, wiązanie A (3 z komórkami RAGE-CHO) i opisane wcześniej (32). Testy bez komórek Wiązanie A. i inne ligandy do SRAGE. Ludzki sRAGE uzyskany z BioVendor został unieruchomiony (10 .g / ml) przez noc w temperaturze 4 ° C na 96-studzienkowych płytkach do mikromiareczkowania i zablokowany 3% albuminą surowicy bydlęcej. Znakowane 125I Ap40, HMGB1 lub S100B w stężeniu 5 nM w nieobecności i obecności różnych stężeń FPS2 lub FPS-ZM1 (10 do 1000 nM) dodano do studzienek (w trzech powtórzeniach) zawierających unieruchomiony test SRAGE i inkubowano przez godzinę. godzinę w temperaturze pokojowej w PBS. Studzienki przemyto zimnym PBS w celu usunięcia niezwiązanych znakowanych radioaktywnie ligandów, a radioaktywność analizowano przy użyciu licznika Gamma Gamma Wallac Wizard. Efekty specyficznej dla RAGE domeny V, domeny C1 i przeciwciał domeny C2 (20 .g / ml) (dostarczonych przez Gunter Fritz) na wiązanie 125I-A 40 (5 nM) do unieruchomionego sRAGE określono w obecności i nieobecności. 100 nM FPS-ZM1. Wiązanie 125I-ligandów z unieruchomionym sRAGE lub jego rekombinowanymi domenami w obecności różnych potencjalnych inhibitorów (np. FPS2, FPS-ZM1, przeciwciała RAGE) wyrażono jako procent kontrolnego wiązania ligandów znakowanych 125I pod nieobecność inhibitorów, które został arbitralnie przyjęty jako 100%. Wiązanie A. do domen RAGE. Rekombinowaną ludzką domenę V RAGE i domeny C1. C2 (dostarczone przez Gunter Fritz) unieruchomiono (10. G / ml) przez noc w 4 ° C na 96-studzienkowych płytkach do mikromiareczkowania i zablokowano 3% albuminą surowicy bydlęcej. Wiązanie 125I-Ay40 (5 nM) z unieruchomioną domeną V i domenami C1. C2 określono w obecności i przy braku 100 nM FPS-ZM1.
[więcej w: zakrzepica żył objawy, zespół fallota, zespół tietza ]