okulista dziecięcy wieliczka

W wirionach oczyszczonych z takich hodowli wykryto tylko dojrzałą, o oporności 100 kDa, postać gpRL13 oporną na Endo. W badaniach frakcjonowania wirionów, białko to oczyszczono za pomocą glikoproteiny B (gB, produkt genu UL55) w rozpuszczalnej frakcji obwiedni, a nie w pp65 (produkt genu UL83) w osłonie (fig. 8A). Przewiduje się, że epitop V5 będzie zlokalizowany topologicznie po wewnętrznej stronie otoczki, a ta orientacja była wspierana przez mikroskopię immunoelektronową, w której znakowane złotem drugorzędowe przeciwciało wykazywało obszerne znakowanie wokół wewnętrznej powierzchni otoczki (Figura 8B). Figura 8 Lokalizacja RL13 w wirionie. (A) Analiza Western przeprowadzona na oczyszczonych wirynach z wirusa wyrażającego skrócone gpRL13 (RCMV1111, RL13a) lub pełnej długości RL13 z C-końcowym znacznikiem epitopowym, gpRL13V5 (RCMV1279, RL13 +). Kompletne wiriony (V), frakcja obwiedni (E) i frakcja szczątków / kapsydów (T) zostały sondowane pod kątem wskazanych antygenów. (B) Immunogolowe barwienie EM dla RL13V5 w oczyszczonych wirionach RCMV1279. Oryginalne powiększenie, × 40 000. Warunkowa ekspresja RL13 i UL128L. BAL pAL 1111 (RL13 A UL128a) ma zastosowanie jako odtwarzalne źródło w pełni scharakteryzowanego, klonalnego HCMV, który wykazuje dobrą stabilność genetyczną i szybki wzrost do wysokich mian w fibroblastach. Pokazujemy także powyżej, że krótkoterminowe eksperymenty można wykonywać przy użyciu Merlin BAC, w którym naprawiane są RL13 i UL128. Główny wpływ fenotypu tych genów na biologię HCMV podkreślił potrzebę współpracy z wirusem WT. Jednakże szybkie pojawienie się mutantów w tych loci podczas amplifikacji z transfekcji Merlin BAC oznaczało, że zapasy wirusa były nieuchronnie zanieczyszczone mutantami. W celu umożliwienia badań z fenotypowym wirusem WT, staraliśmy się tłumić ekspresję RL13 i locus UL128 podczas ekspansji wirusa po transfekcji Merlin BAC. Aby to osiągnąć, unieśmiertelnione hTERT HFFF poddano transdukcji retrowirusem kodującym represor tet zawierający C-końcowy sygnał lokalizacji jądrowej (NLS), a operatory tet wstawiono powyżej kodonu inicjacji translacji genu, który ma być modulowany (62, 63). . W komórkach HFFF-tet represor tet wiąże się z operatorami tet i zapobiega transkrypcji docelowego genu, podczas gdy transkrypcja przebiega normalnie w macierzystych HFFF. Podczas badania z GFP wyrażającym ekspresję tet regulowanym RAd, poziomy ekspresji w komórkach HFFF-tet były zredukowane 180-krotnie w porównaniu do macierzystych HFFF, wykazując niewiele więcej fluorescencji niż komórki zakażone pustym wektorem kontrolnym (Figura 9A). Figura 9Represja UL128L i RL13 przez wirusy pochodzące z BAC w komórkach HFFF-tet. (A) Analiza FACS macierzystych HFFF lub komórek HFFF-tet, zakażonych pustym kontrolnym adenowirusem (RAd-Ctrl) lub eGFP eksprymującym RAd (RAd-GFP). RAd-GFP eksprymuje GFP z promotora MRI HCMV, zawierającego 2 operatory tet 10 bp za blokiem TATA. (B-E) Wielkość wirusów w płytkach generowanych po 2 tygodniach PT w komórkach HFFF (B i D) lub HFFF-tet (C i E), z komórkami nałożonymi w celu zapobiegania rozprzestrzenianiu się wirusa bez komórek, pokazując (B i C) represja UL128L w RCMV1393 i (D i E) represja RL13 w RCMV1448. (F) Miana zapasów wirusów otrzymanych z komórek HFFF-tet zainfekowanych wirusami, w których RL13 i UL131A były kontrolowane (odpowiednio RCMV1448 i RCMV1393) lub wirusy rodzicielskie, w których RL13 i UL131A nie były kontrolowane (odpowiednio RCMV1159 i RCMV1160) ). (G) Wielkość płytki nazębnej wirusa macierzystego (RCMV1160) lub wirusa, w którym UL131A było kontrolowane tet (RCMV1393) w komórkach ARPE19, 3 tygodnie PT. Miejsca inicjacji transkrypcji dla RL13 znajdują się w przybliżeniu 30- i 110-bp powyżej kodonu inicjacji translacji (K
[patrz też: zespół aspergera u dorosłych, zapalenie ucha u dziecka objawy, zespół aspergera test ]