kukuczki 5 6 wrocław

Spontaniczne defekty wyraźnie pojawiają się gdzie indziej w genomie HCMV, jednak ich znaczenie jest tylko sporadycznie definiowane funkcjonalnie (13, 18, 26, 27). Rzeczywiście, sekwencjonowanie całego genomu wielu szczepów klinicznych po in vitro prowadzi do odkrycia, że kliniczne genomy HCMV niezmiennie mutują, czy pasażowane są w fibroblastach, komórkach nabłonka, czy komórkach śródbłonka (28). Istnieje potrzeba opracowania i scharakteryzowania szczepów HCMV o niskim przepływie do zastosowań eksperymentalnych. Jednak generowanie laboratoryjnych szczepów WT HCMV jest problematyczne nie tylko dlatego, że próbki kliniczne często zawierają wiele szczepów (27, 29. 36), ale przede wszystkim dlatego, że adaptacje genetyczne występują nawet we wczesnych etapach pasażowania w hodowli komórkowej. Tak więc, większość szczepów pasażowanych w fibroblastach jest zmutowanych w z 3 sąsiadujących genów (UL128, UL130 i UL131A, wspólnie określanych jako locus UL128, UL128L), których produkty tworzą kompleks związany z glikoproteinami gH i gL w otoczce wirionu (37. 43). ). Mutacje te hamują tworzenie się kompleksu, a tym samym powodują, że wirus nie jest w stanie infekować komórek nabłonka, śródbłonka i niektórych typów komórek szpikowych (12, 44. 48). Genomy kilku szczepów HCMV zostały uchwycone jako BAC, w tym liczba oparta na wirusach o niskim przepływie, i okazują się one nieocenionym źródłem informacji dla badań (49-54). Jednakże żaden z nich nie zawiera pełnego zestawu genów HCMV, zarówno z powodu mutacji, które zachodziły w hodowli komórkowej przed sklonowaniem, jak i w większości przypadków, ponieważ sekwencje zostały usunięte w celu dostosowania do wektora BAC. Ponadto pierwotny materiał kliniczny nie jest dostępny dla większości tych szczepów, co zapobiega weryfikacji sekwencji sekwencji sklonowanych genomów przed niepasożytnymi wirusami. Aby zapewnić niezawodne źródło sekwencji genów HCMV i odtwarzalne źródło genetycznie nienaruszonego, klonalnego wirusa do badań patogenezy, poszukiwaliśmy produkcji zakaźnego BAC zawierającego kompletny gen genu HCMV. Szczep Merlin HCMV (ATCC VR-1590) został wybrany, ponieważ jest oznaczony jako referencyjna sekwencja genomu HCMV przez National Center for Biotechnology Information (GenBank AY446894; RefSeq NC_006273), a pierwotna próbka kliniczna jest dostępna do porównania. Merlin pochodził z moczu zakażonego wrodzonych niemowląt i sekwencjonowano po 3 pasażach (p3) w ludzkich fibroblastach (27). Nasze badanie rozpoczęto od skonstruowania klonu BAC zawierającego kompletny genom szczepu Merlin (p5). Sekwencjonowanie DNA doprowadziło do identyfikacji wyłączających mutacji w genach RL13 i UL128, które najpierw naprawiano pojedynczo, a następnie w kombinacji, w celu wytworzenia BAC zawierających kompletny gen dopełniacza WT. Eksperymenty przeprowadzone na wirusach pochodzących z BAC wykazały, że ekspresja RL13 poważnie upośledza replikację HCMV w hodowlach komórek fibroblastów i nabłonkowych. Tak więc, gdy wirusy wytworzone z BAC zawierających gen WT RL13 pasażowano in vitro, kolejne mutanty pojawiały się szybko, wytwarzając fenotypowo zmieniony wirus o ulepszonych właściwościach wzrostu. Chociaż wiadomo, że RL13 jest członkiem ograniczonego zestawu hiperzmiennych genów HCMV (27), jego ekspresja nie została, według naszej wiedzy, uprzednio scharakteryzowana. Zastosowanie BAC wykazało, że RL13 koduje silnie glikozylowane białko znajdujące się w otoczce wirionu. Ponieważ wirus wytworzony z WT BAC był podatny na mutację, skonstruowano linie komórkowe, w których można było modulować ekspresję RL13 i UL131A. Za to, co uważamy za pierwszy raz, te linie komórkowe pozwalają na przeprowadzenie eksperymentów przy użyciu scharakteryzowanego szczepu HCMV zawierającego pełny dopełniacz genu WT. Wyniki Klonowanie genomu Merlin szczepu HCMV
[przypisy: zespół mielodysplastyczny, zapalenie nerwu twarzowego, zapalenie okostnej objawy ]