kardiolodzy w rzeszowie

Specyficzne problemy związane z adaptacją hodowli tkankowej zostały wyjaśnione i rozwiązane przy użyciu danych o sekwencjach uzyskanych bezpośrednio z oryginalnej próbki klinicznej, która dała początek Merlin. Mutacje, które wpływały na regiony kodujące HCMV, sekwencyjnie naprawiano przez rekombinację, tak że jedynym reliktem wirusa odzyskanym z BAC poprzez transfekcję DNA była sekwencja o 40 bp, zawierająca miejsce loxP i Nhel zlokalizowane pomiędzy regionami kodującymi US28 i US29. Obecność tej sekwencji nie wpłynęła na ekspresję genów flankujących. Wysoki poziom identyczności sekwencji między pAL1053 a szczepem Merlin (p3) wykazał, że genom HCMV doznał minimalnych zaburzeń podczas klonowania BAC. W pAL1053 zidentyfikowano niesynonimowe mutacje w regionach kodujących białka w UL36, UL128 i RL13. Różnice w UL36 były specyficzne dla pAL1053 i jego poprzednika, pAL1031, i przypuszczalnie pochodziły od małej ilości mutantów, które powstały w hodowli komórkowej. Stwierdzono wcześniej, że HCMV i szczepy wirusa cytomegalii rezusa nabrały inaktywujące mutacje w UL36 po pasażowaniu in vitro, co sugeruje, że może istnieć pewna selektywna presja na takie mutanty (14, 64). Po naprawie UL36, uzyskany BAC (pAL1111) dostarczył odtwarzalne źródło klonalnego szczepu Merlin HCMV (RCMV1111; RL13a121212 ., tablica 3), którego właściwości wzrostu były nieodróżnialne od wirusa rodzicielskiego. BAC, w których naprawiono albo geny RL13, UL128, albo oba, wygenerowano z pAL1111 i uzupełniono odpowiednią serią BAC zawierających marker eGFP. PAL1128 i pAL1161 zawierają kompletny zestaw genów HCMV i, jak wierzymy, po raz pierwszy, umożliwiły przeprowadzenie eksperymentów z klonalną populacją skutecznie wirusa WT. Chociaż RCMV1111 i jego odpowiednik wyrażający eGFP (RCMV1158) były stabilne podczas ograniczonej hodowli i odpowiednie do generowania zasobów wirusa o wysokim mianie, naprawa UL128 lub RL13 (lub obu) poważnie zaburzyła wzrost HCMV w HFFF i wiązała się z propagacją tych wirusów z szybkim wyborem dalszych mutantów w tych loci. Dlatego opracowaliśmy linię komórkową HFFF-tet, która pozwoliła na represję RL13 lub UL131A podczas odzyskiwania wirusa z BAC, zapewniając w ten sposób stabilną platformę do eksperymentów na genetycznie nienaruszonym HCMV. Chociaż replikację HCMV opisano w szerokim zakresie typów komórek, wydajną produkcję wirusów in vitro osiągnięto jedynie przy użyciu wirusów przystosowanych do wzrostu w fibroblastach. Rzeczywiście, istniejące systemy hodowli komórkowej wydają się zasadniczo niekompatybilne z wydajną propagacją WT HCMV. HCMV nie jest wyjątkowy pod tym względem. Spośród 8 znanych ludzkich herpeswirusów, tylko wirus WT opryszczki pospolitej typu i 2 (HSV-1 i HSV-2) można łatwo rozmnażać do wysokiego miana w hodowli komórkowej. Niemniej jednak, bardzo wysokie obciążenia wirusem HCMV są często wykrywane w próbkach moczu od noworodków zakażonych wrodzonych (jak miało to miejsce w przypadku próbki, z której wyizolowano Merlin), co wskazuje, że istnieją warunki in vivo, które są kompatybilne z wydajną replikacją WT HCMV. Jest możliwe, że RL13 reguluje przejście na produktywną replikację HCMV in vivo. Locus UL128 jest niezbędny do skutecznej infekcji komórek nabłonka i śródbłonka przez HCMV (37. 43), ale jest szkodliwy dla wzrostu fibroblastów. W konsekwencji, mutanty w tym locus są wybierane, gdy kliniczne izolaty są pasażowane w fibroblastach (12, 26, 27, 44, 45, 47, 48). Merlin został pierwotnie wybrany do szczegółowych badań z serii izolatów klinicznych, częściowo na podstawie jego doskonałych właściwości wzrostu w fibroblastach. Jednak proces ten faworyzował selekcję mutanta UL128, który pojawił się podczas p1 (26).
[podobne: zespół mielodysplastyczny, zapalenie przyzębia, zapalenie ucha u dziecka objawy ]