Identyfikacja płodowego DNA i komórek w zmianach skórnych u kobiet chorych na twardzinę układową czesc 4

Sondy chromosomów X i Y (Oncor) rozcieńczono 1:10 za pomocą Hybrisolu VI (Oncor), a 10 .l pipetowano na każdą sekcję i przykrywano folią z tworzywa sztucznego. Preparaty ogrzewano w temperaturze 70 ° C przez pięć minut, inkubowano przez noc w 37 ° C, przemywano w temperaturze 70 ° C w dwukrotnym roztworze soli cytrynian sodu (1 x sól fizjologiczna cytrynianu sodu stanowi 0,15 M chlorek sodu i 0,015 M cytrynian sodu) przez pięć minut , wybarwiony kontrastowo 0,1 .g 4,6-diamidyno-2-fenyloindolu w roztworze przeciwdziałającym (Oncor) i oglądany przy pomocy mikroskopu epi-fluorescencji (Zeiss, Thornwood, NY) z potrójnym filtrem pasmowym. Jądra w próbkach z biopsji skóry zatopionych w parafinie zbadano za pomocą fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ zarówno dla chromosomu X (fluoresceina), jak i dla chromosomu Y (Texas red). Wyniki z grup kontrolnych i testowych porównano za pomocą testu chi-kwadrat z poprawką Yatesa. Wyniki
Analiza PCR krwi obwodowej i DNA skóry
Sekwencję chromosomu Y amplifikowano z DNA wyekstrahowanego z komórek krwi obwodowej u 32 z 69 kobiet z twardziną układową (46 procent), ale tylko u z 25 normalnych kobiet (4 procent, p <0,001). Klonowanie i sekwencjonowanie potwierdziły tożsamość produktu specyficznego dla chromosomu Y amplifikowanego z próbek DNA kobiet z twardziną układową. Zamplifikowany produkt miał 98 procentową identyczność sekwencji z sekwencją DYZ1 unikalną dla chromosomu Y, wskazując, że była to sekwencja męsko-chromosomowa, a nie niepowiązany gen.
Rycina 1. Rycina 1. Analiza PCR DYZ1 w DNA wyodrębnionym z aktywnych zmian skórnych u kobiet chorych na twardzinę układową. Ścieżka pokazuje znacznik wielkości 100 pz; ścieżka 2 jest pusta; ścieżka 3 pokazuje DNA od normalnego mężczyzny; ścieżka 4 pokazuje DNA od Pacjenta 5; ścieżka 5 pokazuje DNA od Pacjenta 14; ścieżka 6 pokazuje DNA od Pacjenta 15; ścieżka 7 pokazuje DNA od Pacjenta 16; ścieżka 8 pokazuje DNA od Pacjenta 4; ścieżka 9 pokazuje DNA od normalnego mężczyzny; i ścieżka 10 pokazuje DNA od Pacjenta 2. Próbki w ścieżkach 3, 5, 8, 9 i 10 pokazują pasmo odpowiadające 148-bp produktowi zamplifikowanemu z DNA chromosomu Y, jak wskazano strzałką. Szybciej migrujące pasmo we wszystkich ścieżkach reprezentuje tworzenie dimeru-primera, co ilustruje jego obecność w ścieżce 2, która nie zawiera DNA (ślepa próba).
DNA swoisty dla chromosomu Y został wykryty w zmianach skórnych 11 z 19 kobiet, w których był poszukiwany (58 procent), ale w żadnej z próbek biopsji skóry 68 kobiet z chorobą zwyrodnieniową stawów lub ich krewnymi (P <0,001) . Wyniki reprezentatywnego eksperymentu pokazano na fig. 1. Wybitny prążek przedstawia produkt o 148 pz zamplifikowany z DNA chromosomu Y w próbkach od trzech kobiet z twardziną układową (ścieżki 5, 8 i 10, strzałka) i podobny produkt. w DNA z próbek pobranych z biopsji skóry od dwóch normalnych mężczyzn (ścieżki 3 i 9). Szybciej migrujący pas widziany we wszystkich ścieżkach reprezentuje tworzenie dimeru-primera. Próbka otrzymana od Pacjenta 4 (ścieżka 8) miała tak wysokie stężenie męskiego DNA, że wyniki PCR są takie, jak oczekiwano dla wzoru męskiego. Nie wykryto materiału sekwencji swoistej dla chromosomu Y w DNA wyekstrahowanym z aktywnych zmian u kobiet z zespołem mielicy eozynofilii, eozynofilowym zapaleniem powięzi lub zapaleniem wielomięśniowym.
Fluorescencja in situ Hybrydyzacja komórek krwi obwodowej
Tabela 1
[przypisy: Corsodyl, atropina, noni ]
[hasła pokrewne: zapalenie nerwu twarzowego, zapalenie okostnej objawy, zapalenie przyzębia ]