Identyfikacja płodowego DNA i komórek w zmianach skórnych u kobiet chorych na twardzinę układową cd

Wyniki sekwencji analizowano za pomocą programu GenBank Search. Fluorescencja in situ Hybrydyzacja komórek krwi obwodowej
Krwinki obwodowe trzech kobiet z twardziną układową, które nosiły męskie płody, jedna kobieta z twardziną układową, która nigdy nie była w ciąży, i dwie normalne kobiety zostały rozdzielone przez urządzenie do separacji komórek magnetycznych (Immunicon, Huntington Valley, Pa.). Jednojądrzaste komórki krwi obwodowej wyizolowano przez odwirowanie Ficoll-Hypaąue (Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) i przemyto dwukrotnie solanką buforowaną fosforanem zawierającą 0,1% albuminy surowicy bydlęcej. Komórki ponownie przeprowadzono w stan zawiesiny w 0,85 ml roztworu i dodano 20 .l (0,25 .g na mililitr) mysich przeciwciał monoklonalnych skierowanych przeciwko CD3 (komórki T) lub przeciwko CD14 (monocyty) i CD45 (leukocyty). Mieszaniny reakcyjne inkubowano w temperaturze pokojowej przez 25 minut i dodano 0,85 ml świeżo przygotowanego rozcieńczenia 1:20 kozich przeciwciał przeciw mrówce sprzężonych z koloidalnymi cząstkami magnetycznymi (Immunicon). Po kolejnych 10 minutach inkubacji komórki przemyto 10 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanem, odwirowano i ponownie zawieszono w 1,7 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanem.
Ponownie zawieszone komórki przeniesiono do naczynia zbiorczego i umieszczono w polu magnetycznym na 15 minut w temperaturze pokojowej. Nowe naczynie do zbierania zawierające 1,7 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanem zostało następnie podniesione do pętli zbierających, a komórki odzyskano przez wstrząsanie urządzenia do zbierania przez jedną do dwóch minut. Komórki odzyskane z pętli drucianych i te, które nie przylegają do pętli zawieszono w 50 .l świeżego roztworu 3: metanol-kwas octowy w celu utrwalenia. Następnie od 30 do 40 .l zawiesiny komórek przeniesiono na czyste szkiełka i wysuszono na powietrzu. Liczba komórek na każdym slajdzie wynosiła w przybliżeniu 5000 na centymetr kwadratowy. Sondy chromosomów X i Y nakładano na szkiełka i inkubowano w sposób opisany poniżej dla odcinków tkanek. Sygnały wizualizowano za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego Leitz Orthoplan II z potrójnym filtrem pasmowym (Leitz, Rockleigh, NJ). U każdego pacjenta badano 3000 jąder i rejestrowano liczbę sygnałów dla każdej sondy. Rejestrację i rejestrację obrazu przeprowadzono za pomocą systemu analizy obrazu Oncor (Oncor, Gaithersburg, MD).
Fluorescencja in situ Hybrydyzacja próbek do biopsji skóry zatopionych w parafinie
Skrawki wycinano z próbek biopsji skóry pobranych z parafiny od siedmiu kobiet z twardziną układową, u których amplifikacja DNA DNA uzyskanego ze zmian skórnych dała fragment o wielkości 148 par zasad. Skrawki analizowano pod kątem obecności komórek pozytywnych pod względem chromosomu Y przez fluorescencyjną hybrydyzację in situ. Próbki biopsji skóry od 10 kobiet bez twardziny układowej badano jednocześnie. Skrawki odparowano w ksylenie przez 10 minut i przemyto dwukrotnie przez 5 minut każdy w 100 procentach etanolu. Skrawki traktowano 0,1% pronazą w 45 ° C przez 10 minut, a następnie 0,25 mg proteinazy K na mililitr w 45 ° C przez 30 minut, po czym odwadniano je w 70, 80 i 95 procentach etanolu przez minutę. każdy
[patrz też: ambroksol, alprazolam, bifidobacterium ]
[hasła pokrewne: zakrzepica żył objawy, wash master, olx jastrzębie zdrój ]